新冠病毒能导致嗅觉丧失，具体机制是什么？这篇文章或许给了思路

SARS-CoV-2（CoV-2）是一种引起COVID-19综合征的大流行性冠状病毒，包括上呼吸道感染（URI）症状、严重呼吸窘迫、急性心脏损伤和死亡。CoV-2与其他冠状病毒密切相关，包括大流行性SARS和MERS的致病因子（分别是SARS-CoV和MERS-CoV）以及与轻度URI综合征相关的地方性病毒（hCoV-OC43、hCoV-HKU1、hCoV-229E和hCoV-NL63）。

临床报告表明，感染CoV-2有高发病率嗅觉和味觉障碍，以及嗅觉缺失。

虽然许多病毒（包括冠状病毒）会因炎症反应而引起短暂的嗅觉变化，

但据报道，在某些情况下，在没有明显的鼻腔炎症或鼻炎症状的情况下，会出现与冠状病毒相关的嗅觉缺失。

此外，从冠状病毒相关的嗅觉缺失中恢复通常需要数周，而从典型的病毒后嗅觉缺失（通常是由嗅觉感觉神经元（OSN）的直接损伤引起）的恢复通常需要数月。

这些观察结果表明，CoV-2可能通过不同于其他病毒的机制来处理气味，CoV-2改变气味感知的具体方式仍然未知。

SARS-CoV-2通过其S蛋白和靶细胞ACE2蛋白的相互作用感染细胞。这种相互作用需要S蛋白被细胞表面蛋白酶TMPRSS2裂解，其他蛋白酶（如组织蛋白酶B和L，CTSB/CTSL）也可能参与。

假设，识别易受CoV-2直接感染的特定细胞类型（如ACE2和TMPRSS2的表达）将有助于深入了解COVID-19改变嗅觉感受的可能机制。

鼻腔RE与呼吸道的上皮细胞相连，当空气进入鼻腔时，会被湿润；主要的细胞类型包括基底细胞、纤毛细胞、分泌细胞（包括杯状细胞）和刷状/微血管细胞（下图）。

相比之下，OE负责气味检测，因为它拥有成熟的嗅觉感觉神经元（OSN），这些OSN通过位于树突纤毛上的受体与气味相互作用。

OSN由支持细胞支持，这些细胞在结构上支持感觉神经元，吞噬和/或解毒潜在的损伤因子，并维持局部的盐和水平衡；

微绒毛细胞和分泌黏液的鲍曼腺细胞在维持OE的稳态和功能方面也起着重要作用（图1）。

此外，OE还含有球状基底细胞（GBCs），主要负责正常上皮细胞更新过程中OSN的再生，以及水平基底细胞（HBCs），在组织损伤时起到储备干细胞的作用。

气味信息通过OSN轴突从OE传递到大脑，这些轴突刺穿颅底的筛板，终止于嗅球（OB）。在OB内部，局部电路处理嗅觉信息，然后将其发送到更高的大脑中心（图1）。

最近通过单细胞RNA测序分析（以下简称scSeq）证明，来自人类上呼吸道的细胞-包括鼻杯状细胞和纤毛细胞-表达高水平的ACE2和TMPRSS2，这表明这些RE细胞类型可能在CoV-2感染期间作为病毒库。

然而，这些数据集中的分析样本不包括任何OSN或支持细胞，表明这些实验中的组织取样不包括OE。

在这里，我们从嗅觉系统中查询新的和以前发表的大量RNA序列和scSeq数据集，以了解与冠状病毒进入有关的ACE2、TMRPSS2和其他基因的表达。发现，嗅球和嗅球中的非神经元细胞，包括支持细胞、干细胞和血管周围细胞，表达CoV-2进入相关转录物及其相关蛋白，提示这些非神经元细胞类型的感染可导致COVID-19患者的嗅觉缺失。

在成熟的OSN中未检测到ACE2和TMPRSS2，而这些基因在支持细胞和HBc中都检测到（图2A-D和S1B-E）。相反，与其他COV病毒进入细胞相关的基因在OSN和其他OE细胞类型中表达。

通过对人嗅上皮活检组织的免疫染色证实了ACE2蛋白的表达，这表明在支持细胞和基底细胞中有表达，而在OSN中没有ACE2蛋白（图2E和S2）。

这些结果表明，支撑干细胞和嗅觉干细胞（sustentacularandolfactorystemcells）（而不是成熟的OSN）可能是人类OE中CoV-2的直接靶点。

由于鼻咽是CoV-2感染的主要部位，比较了人类RE和OE细胞类型中ACE2和TMPRSS2表达的频率。在OE中，支持细胞表达ACE2频率最高（2.9%），但这一频率略低于呼吸纤毛细胞和分泌细胞（分别为3.6%和3.9%）。所有的HBC亚型都表达ACE2，但与呼吸型HBC（1.7%的细胞）相比，嗅觉HBC（0.8%的细胞）表达ACE2频率更低（图2D）。

此外，所有其他RE细胞亚型均显示ACE2和TMPRSS2的表达频率高于OE细胞。

这些结果表明，在OE的特定细胞类型中存在关键的CoV-2进入相关基因，但其表达水平低于从人鼻黏膜分离的RE细胞。

为了解决这个问题，我们开发了一个两步比对程序，在这个过程中，首先寻找在OE和RE中常见的细胞类型，然后利用这些常见细胞类型中的基因表达模式来规范OE和RE中所有细胞类型的基因表达水平（图3和S3）。

这种方法显示RE中的粘膜下腺杯状细胞和OE中的Bowman腺细胞之间存在对应关系（96%的映射概率，见方法），RE中的肺离子细胞和OE中的一部分微血管细胞之间对应（99%的映射概率，见方法和图S3），

发现人类OE支持细胞表达ACE2和TMPRSS2的水平与在非鼻呼吸道的其他部分观察到的水平相似（图3C）。

由于CoV-2可以感染下呼吸道的细胞，这些结果与人类嗅上皮中的特定细胞类型在允许直接感染的水平上表达ACE2的可能性是一致的。

为了进一步探索CoV-2细胞进入基因在嗅觉系统中的分布，看小鼠不同类型细胞的表达情况，这使得人类无法进行疑问实验。为了评估小鼠表达模式是否与人类OE中观察到的表达模式一致，研究了已发表的数据集，其中RNA序列独立地在小鼠子宫内膜和成熟OSN的纯化群体上执行。

受体ACE2和蛋白酶TMPRSS2在子宫内膜中表达，组织蛋白酶CTSB和CTSL也表达（图4A和S4A）。然而，这些基因的表达（CTSB除外）要低得多，ACE2在纯化的OSN样本中几乎没有表达（图4A和S4A，计数见图例）。

其他冠状病毒进入细胞的受体基因也在wholeolfactorymucosa(WOM)中表达，并在纯化的OSN中表达。另外两个小鼠RNA序列数据集（47，48）也观察到了OSN中Ace2和Tmprss2相对于子宫内膜的去富集（图S4B）。这些数据表明，与人类一样，Ace2和其他CoV-2进入相关基因在小鼠嗅上皮中表达。

为了确定表达Ace2和Tmprss2的特定细胞类型，我们对小鼠子宫内膜进行了scSeq（通过Drop-seq，见方法）（图4B）。这些结果与在人类上皮细胞中的观察结果一致：Ace2和Tmprss2在一部分支持细胞和鲍曼腺细胞中表达，在一小部分干细胞中表达，但在OSN中不表达（17666例中，0例确认为成熟的OSN，图4C和S4C-D）。

值得注意的是，只有背侧的支撑细胞表达标记物Sult1c1和Acsm4，Ace2才呈阳性（图4D和S4D-E）。

事实上，对人类支持细胞ACE2阳性亚群的再分析表明，所有阳性细胞都表达与背部上皮相关的遗传标记。一个独立的小鼠scSeq数据集证实嗅觉感觉神经元不表达Ace2（28769个成熟osn中有2个Ace2呈阳性），而在一小部分Bowman腺细胞和hbc中观察到表达。在该数据集中未观察到支撑细胞的表达，该数据集包括相对较少的背部支撑细胞。

用抗ACE2抗体对小鼠子宫内膜进行染色，证实ACE2蛋白在支持细胞中表达，并且特别定位于支持细胞微绒毛上（图5）。ACE2阳性支持细胞仅在OE的背侧亚区被鉴定；关键的是，在该区域内许多（可能全部）支持细胞表达ACE2（图5B-E）。在鲍曼腺细胞中也观察到染，但在OSN中没有观察到，并且在RE细胞亚群中也观察到了染色（图5F-G）。

综上所述，这些数据表明，ACE2是由小鼠和人类背部上皮中特异性存在的支持细胞表达的。

ACE2蛋白在小鼠嗅和呼吸上皮中检测。（上图）

（A）小鼠主要嗅上皮ACE2免疫染色。冠状切面所示，ACE2蛋白在背侧区和呼吸上皮中被检测到。上皮层下的点状Ace2染色可能与血管系统有关。Bar=500μm。箭头表示ACE2表达的边缘，与假定的背侧区相对应（在G中确认）。虚线框表示B和G（左）中显示的区域。

（B）ACE2蛋白在嗅上皮背侧区表达检测。Bar=50μm。

（C）NQO1（一种在OSN背侧区表达的蛋白）共染色证实了ACE2在嗅上皮中的特异性表达。Bar=50μm。

（D）CNGA2(嗅感觉神经元的纤毛),与嗅背上皮的ACE2信号不重叠。Bar=50μm。

（E）高倍镜下嗅上皮顶端的图像显示，ACE2信号定位于支持细胞的绒毛顶端（F-Actin）显示，但不与嗅感觉神经元的纤毛重叠，如乙酰化微管蛋白（）所示。Bar=10μm（F）鲍曼腺ACE2染色呈阳性。Bar=50μm。

（G）ACE2在呼吸上皮中的表达，通过TUBB4的共染色得到证实。Bar=50μm。

病毒损伤可导致OE生理学的广泛变化，伴随着负责上皮再生的干细胞群的招募。为了表征在类似情况下Ace2表达的分布，用甲巯咪唑（它同时烧蚀支持细胞和OSN）来损伤小鼠的OE，然后在随后的再生过程中对HBc及其后代执行scSeq。这项分析显示，损伤后，Ace2和Tmprss2在支持细胞亚群和HBc中表达，以及在激活的HBc中表达，这些HBCs用于上皮细胞的再生（图6A-C和S6A；注意激活的HBc表达Ace2的水平高于静止的HBc）。

对Ace2阳性支持细胞群的分析显示背部上皮标志物的表达（图6D）。为了验证这些结果，我们重新分析了一个类似的数据集，在该数据集中，识别出的HBc及其后代接受基于Smart-seq的深度测序。在这个数据集中，Ace2在0.7%以上的基底细胞、近2%的活化HBc和近3%的支持细胞中检测到，但在OSN中未检测到（图S6B）。抗ACE2抗体的免疫染色证实，在这些再生条件下，活化的干细胞中存在ACE2蛋白（图6E）。这些结果表明，在损伤过程中被激活的干细胞表达ACE2，并且表达水平高于静息干细胞。

考虑到鼻腔中的RE和OE可能直接感染CoV-2，评估了Ace2和其他CoV进入基因在小鼠嗅球（OB）中的表达，OB通过颅神经I（CNI）直接连接到OSNs；原则上，OB功能的改变可以独立于功能改变而导致嗅觉缺失在运行经验中。为此，对鼠OB执行scSeq（使用Drop-seq，see-Methods），并将这些数据与之前发布的OB-scSeq分析合并，得到一个包含近50000个单细胞（见方法）的数据集。

这项分析显示，在OB神经元中不存在Ace2的表达，而只在血管细胞中观察到，主要是周细胞，这些细胞参与血压调节、血脑屏障的维持和炎症反应（图。7A-D和S7-8）。虽然其他潜在的CoV蛋白酶在OB中表达，但Tmprss2没有表达。

还对单个OB多巴胺能球旁神经元进行了基于Smart-seq的深度测序，OB小球层的局部中间神经元群（像簇状细胞一样）可以从鼻OSN直接接收单突触输入（图7E）

这些实验证实了Ace2和Tmprss2在这种类型的细胞中实际上没有表达。免疫组化显示血管内ACE2蛋白表达水平较高，尤其是周细胞；

事实上，几乎所有周细胞都显示出一定程度的ACE2抗体染色。与scSeq结果一致，在任何类型的神经元细胞中均未观察到染色（图7F-G）。

这些观察结果至少对一些其他大脑区域也适用，因为对来自神经系统不同区域的10个基于SMART-Seq2的深度测序数据集的重新分析表明，神经元中几乎完全没有Ace2和Tmprss2的表达，这与先前的免疫染色结果一致。

鉴于上述ACE2和TMPRSS2在小鼠和人类中的表达模式的广泛相似性，这些发现（来自小鼠实验）表明OB神经元可能不是感染的主要部位，但血管周细胞可能对CoV-2敏感。

在这里，发现小鼠和人类样本中的OE支持细胞、HBC和Bowman腺细胞亚群表达CoV-2受体ACE2和棘突蛋白蛋白酶TMPRSS2。人类OE支持细胞表达这些基因的水平与在肺细胞中观察到的水平相当。相比之下，我们没有在成熟的osn中检测到ACE2在转录或蛋白质水平上的表达。

同样，OB中的小鼠血管周细胞表达ACE2，而我们在OB神经元中没有检测到ACE2。因此，在COVID-19患者中，非神经元细胞型的原发感染可能是导致嗅觉缺失和相关嗅觉障碍的原因。

OE和OB中易受CoV-2感染的非神经元细胞类型的鉴定表明，COVID-19患者急性嗅觉丧失的四种可能的、非相互排斥的机制。

首先，鼻腔和球部的支持细胞和血管细胞的局部感染可引起显著的炎症反应（包括细胞因子释放），其下游效应可阻断有效的气味传导，或改变OSNs或OB神经元的功能。

第二，对支持细胞（负责局部水和离子平衡）的损害可能间接影响从OSN到大脑的信号传导。

在小鼠模型中，支撑细胞和鲍曼腺细胞的损害会导致OSN死亡，进而导致嗅觉丧失。

最后，血管损伤可导致低灌注和炎症，导致OB功能改变。

尽管仅在OE细胞的一个子集中发现ACE2转录物，但这种低水平的观察到的表达水平与在COVID-19患者中被CoV-2感染的呼吸细胞中观察到的水平相匹配或更高（图3）。关键的是，小鼠的免疫染色显示ACE2蛋白（几乎）在背侧OE的支持细胞中广泛表达，scSeq很少检测到ACE2转录物。同样，几乎所有的血管周细胞也表达ACE2蛋白，只有一小部分OB周细胞的ACE2转录物呈阳性。

虽然Ace2转录本比蛋白质更少见，但在细胞类型水平上有一个明确的一致性：在特定细胞类型中，ace2的mrna的表达准确地预测了Ace2蛋白的存在，而Ace2转录阴性的细胞类型（包括osn）不表达Ace2蛋白。这些观察结果与最近在呼吸上皮中的发现一致，这表明scSeq大大低估了特定细胞类型中表达Ace2转录物的部分，但是通过更敏感的分析形式并没有发现“新的”Ace2表达细胞类型。如果我们在小鼠OE中的发现转化为人类（这是一个合理的可能性，因为两个物种之间表达CoV-2细胞进入基因的嗅觉细胞类型精确匹配），那么ACE2蛋白很可能在人类支持细胞的一个重要亚群中表达。因此，在人的上皮细胞中可能存在许多可用于CoV-2感染的嗅觉支持细胞，而这些细胞反过来又可招募弥漫性炎症过程。然而，OE的损伤仍有可能是由更有限的细胞感染引起的。例如，SDAV冠状病毒感染大鼠的支持细胞亚群最终导致OE整体结构的破坏，这表明局灶性冠状病毒感染可能足以造成弥漫性上皮损伤。

观察到，损伤后被激活的HBc表达Ace2的水平高于静息干细胞。CoV2诱导的嗅觉缺失的自然史现在才被定义；虽然许多患者的嗅觉恢复时间在几周内已经有报道，但仍不清楚在一部分患者中，嗅觉障碍是持久的还是永久的。虽然干细胞感染本身不太可能导致急性嗅觉缺陷，但在COVID-19相关嗅觉缺失持续存在的情况下，CoV-2感染干细胞的能力可能发挥重要作用，在这种情况下，干细胞的感染会随着时间的推移抑制OE的再生和修复。

多项免疫染色研究显示，人脑中的ACE2蛋白主要或仅在血管系统中表达（并在周细胞内特异表达），许多与CoV-2感染相关的神经症状如中风或意识改变与潜在的血管病变相一致。

此外，迄今为止，人类脑脊液样本还没有发现CoV-2rna，人类患者的尸检发现，在取样器官中，大脑中的CoV-2含量最低。

另一方面，许多其他研究表明，ACE2可能在人类神经元和胶质细胞中表达。此外，最近两项对表达人类ACE2的小鼠模型的研究发现，鼻腔接种后，大脑中存在CoV-2，尽管这两项研究都没有明确质疑OB；这项工作与非人灵长类动物COVID-19模型的结果相反，其中鼻腔感染不会导致大脑中出现可识别的CoV-2抗原。

注意到有几条警告削弱了我们的结论。尽管目前的数据表明，ACE2是体内CoV-2最有可能的受体，但也有可能（尽管尚未证明）其他分子（如BSG）可使CoV-2独立于ACE2进入（图S1E、S4C、S5E、S6A）。此外，最近有报道称，ACE2的低水平表达可支持CoV-2细胞进入（86）；因此，在我们的检测水平以下的ACE2表达有可能使明显ACE2阴性细胞类型的CoV-2感染。我们还提出嗅觉系统的损害可能是由于原发性感染或继发性炎症；感染CoV-2的细胞可能与不表达ACE2的细胞形成合胞体。这种机制可能会损害邻近受感染细胞的神经元。最后，最近有报道说炎症可以诱导人细胞ACE2的表达。因此，我们对ACE2表达的调查，以及其他最近的报告表明ACE2在OE支持细胞和干细胞中表达，而不是神经元，可能不足以代表CoV-2感染条件下表达ACE2的细胞类型。

COVID-19相关嗅觉缺失的任何合理的病理生理学机制都必须解释与地方性病毒相关的嗅觉障碍的高外显率、嗅觉丧失的明显突然性（可先于其他症状的发展）和许多患者的短暂性功能障碍；确定COVID-19介导的嗅觉缺失的疾病机制还需要进一步的研究。尽管如此，我们在OE和OB表达的分子中鉴定出与CoV-2进入有关的细胞，为将来的研究指明了一条道路。