哺乳动物胚胎的发生始于一个全能受精卵，逐渐发育成桑葚胚，然后形成囊胚（blastocyst）。囊胚的外胚层（epiblast,EPI）将发育为胚体和羊膜，滋养外胚层（trophectoderm,TE）和原始内胚层（primitiveoderm,PE）则分别发育为胎盘和卵黄囊。TE由滋养层细胞（trophoblasts,TRs）组成，是一种充满液体的上皮胞囊。EPI被不对称地放置在TE胞囊中，其位置定义了第一发育轴polar-mural，也称为embryonic-abembryonic（图1A）。紧邻EPI的TE（polarTE）增殖并自我更新，进而逐渐将胎盘构建成一个复合器官，履行关键功能（例如气体交换、废物排泄和免疫功能）；与EPI分离的TE（muralTE）与TE分化、增殖减少以及附着在子宫上的能力有关。因此，囊胚腔的一个功能是分离将形成胎盘或介导初始子宫附着的TRs库。为了应对囊胚植入，子宫细胞增殖并经历功能变化以产生蜕膜。蜕膜为胚胎植入、胎盘发育提供营养和免疫豁免，是子宫内膜基质细胞为适应妊娠而发生的形态学及生理学改变。错误的蜕膜化与不孕和流产有关【1】。

在囊胚中，滋养层细胞的模式化确保了成功的植入和胎盘发育。近日，来自奥地利科学院分子生物技术研究所的团队在CellStemCell杂志在线发表了题为Epiblastinducerscapturemousetrophectodermstemcellsinvitroandpatternblastoidsforimplantationinutero的文章。研究人员鉴定了一组由外胚层分泌的最优诱导剂（FGF4、TGFβ1、IL11、Activin、Bmp7、LPA、8-BrcAMP），可在体外获得稳定、高度自我更新的类似于囊胚期的小鼠滋养外胚层干细胞（trophectodermstemcells,TESCs）。TESCs具有更强的形成胚状体（Blastoids,囊胚样结构）的能力，能在子宫内更有效地诱导蜕膜形成，进而促进胚胎着床。

为了探究TRs在不同位置、植入前后的区别，作者首先使用单细胞mRNA测序（scRNA-seq）数据【2】对细胞进行分析，发现polarTE和muralTE转录组存在明显差异（图1）。PolarTE中调节TR自我更新的TFs（Cdx2、Esrrb和Elf5）、Wnt配体Wnt7b和BMP1/4/8b和受体Il6st增加；调节TR增殖的通路和基因上调，包括MAPK通路（Fgfr1、Mapk1、Map2k1、Grb2和Spry2）和增殖机器（Cdk1、Ccnb1-2、Ccnd1、Mki67和Pcna）；SMAD信号通路的效应子（E2f4、Smad3、Smad4和Smad7），以及调节Cdx2的Hippo通路成员（Amot、Lats2、Ywhab和Wwc1）和靶标（Max、Myc和Ccnd1）也上调。这些数据表明，STAT、SMAD和Hippo通路在polarTE中得到了增强。而MuralTE的特征包括与中间细丝（Krt8/18）和紧密连接（Ocln、Pard3和Pard6b/g）形成相关的分子以及转录因子Gata2、Klf4/5/9、Tfap2a和Tcf7l2。随后，作者比较了TE（）和ExE（extraembryonicectoderm,胚外外胚层，，植入后）TRs的转录组【3】，发现分泌配体Bmp4和Igf2的表达增加，而与胰岛素信号传导相关的基因表达减少。

图1.PolarTE与MuralTE细胞转录组差异分析

接下来，作者探究了滋养层干细胞（TRstemcells,TSCs）的异质性。通过对CDX2high（CDX2在晚期小鼠囊胚中标记polarTE）和CDX2lowTSCs进行RNA-seq，鉴定了1941个差异表达基因。CDX2highTSCs中富集了调控自我更新的TFs（Esrrb、Eomes和Eif5）、细胞周期组分、Hippo通路和一些极性标志物（Ly6a和Ddah1）；相反，CDX2lowTSCs高表达分化标志物Krt8和Gata2。通过scRNA-seq分析来描述TSC的异质性，显示TSCs存在三个亚群（cluaster3、4和5）：Cluster4富集了TE相关基因，包括与上皮细胞相关的基因（Cldn4/6、Krt18、Epcam、Ctnna1、Lgals9、Krt8/18和Itga6）；Cluster3富集了ExE基因（Eomes、Elf5、Hand1、Tead2、Id1、Cited2和Bmp4）；Cluster5基本没有TE和ExE基因，反映了更多分化的TRs。因此，TSCs包含3个亚群：滋养外胚层、胚外外胚层和分化的滋养层。这些TSCs亚群反映了功能不同且可互换的干细胞状态：CDX2high细胞存在于细胞周期的所有阶段，而CDX2low细胞主要存在于G0/G1期；CDX2high细胞的致克隆率是CDX2low细胞的3倍，CDX2low细胞在去除FGF4/TGFb1后更容易分化；在CDX2high或CDX2low细胞分选后5天内，这些亚群重新建立了初始异质性。

进一步，作者通过检测EPI分泌因子在TSCs中诱导CDX2的能力，筛选到一组可诱导产生稳定的CDX2highTSCs的最优分子（EPI诱导剂）：FGF4（25ng/mL）、TGFb1（2ng/mL）、Activin（50ng/mL）、IL11（50ng/mL）、BMP7（25ng/mL）、8-BrcAMP（200nM）、LPA（5nM）（简称TXV）。在TXV中培养TSCs（1）增强了它们与TE的转录组相似性；（2）增强了自我更新；（3）抑制了与分化相关的基因表达；（4）保持了其快速分化和嵌合ExE的潜力；（5）具有增强的潜力来复刻TE上皮形态发生的特征。因此，作者将这些细胞称为滋养外胚层干细胞（trophectodermstemcells,TESCs）。随后，作者发现EPI诱导剂可局部作用于TEpolar-muralaxis，TESCs具有更强的形成blastoids的能力。

最后，作者探究了EPI诱导剂与蜕膜形成之间的联系。在初始附着（~）之后，囊胚指示子宫形成蜕膜组织（~），但来自不同TRs库的贡献尚不清楚【4】。与TSCs相比，由TESCs或CDX2i-TSCs（CDX2诱导转基因-TSCs）形成的blastoids具有增强的蜕膜化能力，它们形成与囊胚大小相似的蜕膜，表明EPI诱导剂有助于TE进行蜕膜化。用GW501516（PPARd受体激动剂，赋予TE植入能力）处理blastoids，将降低CDX2表达及蜕膜化的可能性，表明CDX2表达赋予TR对子宫组织蜕膜化的能力。随后，作者试图鉴定（1）其分泌受CDX2调节的分子和（2）可能有助于蜕膜化的分子。通过SCENIC计算框架分析，预测了多个Wnt配体（Wnt6和Wnt7b）和受体（Fzd2/7/10），其启动子区域可能与CDX2结合。在囊胚中，Wnt7b转录本最丰富，其次是Wnt6。WNT7B在TE及其衍生物中高表达，Wnt6/7b表达在ExE中保持。由Wnt6或Wnt7bKOTESCs形成的blastoids最初附着在子宫上，与野生型相当（），但发育至时，蜕膜的大小显著减小。这些数据表明，EPI诱导剂不仅维持了局部TR增殖和自我更新，而且促进了WNT6/7B的分泌，刺激子宫蜕膜，有利于胚胎植入。

总的来说，该研究提供了一个框架来解释胎体如何利用诱导和TR状态波动来维持祖细胞、促进分化或分配和平衡植入发生所需的功能（图2）。作者表明EPI诱导剂的特定组合增加了TF网络（CDX2，EOMES和ESRRB）的最优性，增强了自我更新，并防止了分化。而对诱导剂的次优暴露有利于祖细胞状态的波动，从而产生具有促进分化的可逆亚群。这种EPI/TR界面的动态调节赋予祖细胞池一种灵活的策略，以维持更多的祖细胞或产生分化的细胞类型。该研究也存在一定的局限性：（1）由TESCs形成的胚层植入子宫并有效地形成了蜕膜，但并没有观察到胎儿的形成，尚未满足发育的最低要求；（2）基于TSCs中RNA-seq、ChIP、TESC和CDX2过表达分析，以及这些基因在人囊胚TE中的表达模式，选取了WNT6和WNT7b作为CDX2的下游效应子。然而，蜕膜化是一个涉及多个参与者的复杂过程，除了WNT6/7b，胎体分泌的其他分子也可能会影响蜕膜化。

图2

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制版人：十一

参考文献

1.Cha,J.,Sun,X.,andDey,(2012).Mechanismsofimplantation:,1754-1767.

2.Nakamura,T.,Yabuta,Y.,Okamoto,I.,Aramaki,S.,Yokobayashi,S.,Kurimoto,K.,Sekiguchi,K.,Nakagawa,M.,Yamamoto,T.,andSaitou,M.(2015).SC3-seq:amethodforhigh,e60.

3.Posfai,E.,Schell,,Janiszewski,A.,Rovic,I.,Murray,A.,Bradshaw,B.,Yamakawa,T.,Pardon,T.,ElBakkali,M.,Talon,I.,etal.(2021).,49-60.

4.Rivron,,Frias-Aldeguer,J.,Vrij,,Boisset,,Korving,J.,Vivie,J.,Truckenmuller,,vanOudenaarden,A.,vanBlitterswijk,,andGeijsen,N.(2018).,106-111.

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