STAT3抗肿瘤小分子抑制剂的研究进展：从磷酸化抑制到蛋白降解

STAT3是细胞内重要的信号通路，持续活化与癌症的发生发展密切相关，靶向STAT3的小分子抑制剂的开发是抗肿瘤药物研发的热门之一，2021年7月，中国科学院大学附属肿瘤医院(浙江省肿瘤医院)的Jiang-JiangQin教授在JMC上发表综述，总结了近五年来靶向STAT3抗肿瘤小分子抑制剂的研究进展。

信号转导和转录激活因子(SignalTransducerandActivatorofTranscriptionSTAT)属于细胞质转录因子家族蛋白，负责胞外细胞因子和生长因子信号转导以及基因转录的激活。STAT具有信号转导和转录激活双重功能,当细胞因子或生长因子激活相应受体后,STAT蛋白被激活,将胞外信号转入细胞核内,从而调控相关基因的转录与表达。在哺乳动物细胞中有7个STAT家族成员，包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5α，STAT5β，STAT6，它们具有20-50%的同源性。细胞周期控制、细胞存活和免疫应答等许多相关基因受到STAT蛋白的调控。

STAT2是I型干扰素(IFN-α/β)信号传导通路的关键转录因子，在介导抗病毒免疫和抗增殖信号中发挥重要作用。STAT4和STAT6可分别受到IL-12和IL-4的激活，是免疫应答调控的中心调节因子。除了调节免疫应答作用外，STAT1也能抑制肿瘤细胞增殖，并促进肿瘤细胞凋亡。与STAT1相反，STAT3和STAT5蛋白都是JAK-STAT信号通路的下游致癌介导因子，而该通路能够促进癌细胞增殖和存活。STAT3控制着细胞周期进程和抗细胞凋亡，因此，最常与多种人类癌症的发展和不良预后有关。除了参与癌症进程，STAT3也参与类风湿性关节炎、克罗恩病、动脉粥样硬化和炎症性肠病等自身免疫和炎症疾病进展。因此，STAT3已成为具有吸引力的癌症、免疫以及炎症疾病治疗靶点，开发抑制剂作为STAT3相关的疾病治疗成为重要的药物研究方向。

STAT3广泛存在于各类细胞和组织中，能够被多种细胞因子激活，在正常生理状态下，STAT3的活化快速而短暂，但在多种肿瘤细胞中，STAT3则被持续性激活并呈高表达水平，与肿瘤的发生发展密切相关。

STAT3由大约770个氨基酸组成，相对分子量为88kDa，哺乳动物细胞中存在四种异构体：STAT3α，STAT3β，STAT3γ，STAT3δ。

STAT3和其他同家族成员具有共同的结构基序，包括N端结构域(NTD,残基1-138)、coiled-coil结构域(CCD,残基139-320)、DNA结合域(DBD,残基321-494)、linker结构域(LD,残基495-583)、Srchomology2结构域(SH2,残基584-688)、转录激活结构域(TAD,残基689-770)，在信号传导和基因转录激活过程中，每一个结构域都发挥着不同的作用。

图：STAT3结构及序列

N端结构域是一个保守序列，具有多种功能，如STAT3二聚体核转位以及后续的协同DNA结合；CCD由四个α螺旋通过短环连接组成，具有大的亲水表面，主要参与STAT3向其受体的募集；DBD由8股β-折叠(β-barrel)组成，负责识别并结合特异性的DNA序列；LD由一系列α螺旋组成，可将DBD和SH2结构域连接起来，突变研究表明LD对转录激活是关键的；SH2结构域是该家族中最高度保守的区域，对于TAD区域特异性酪氨酸残基磷酸化后STAT3二聚体的形成是必需的。TAD中的Tyr705和Ser727是STAT3的两个重要磷酸化位点，一旦Tyr705被磷酸化而活化，能够通过促进其中一个STAT3单体的磷酸化Tyr705位点结合到另一个STAT3单体的SH2结构域，进而促进STAT3二聚化。同样，Ser727的磷酸化进一步增强STAT3靶基因的转录。其中,N端结构域、DNA结合域和SH2结构域的作用最为重要,靶向这三个结构域中的任意一个均能达到直接抑制STAT3活性的效果。

非刺激状态下，失活的STAT3位于胞质中。当受到生长因子、细胞因子以及致癌蛋白激活时，例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白介素6(IL-6)、IL-10、IL-11、干扰素-g(IFN-g)结合到它们的细胞表面同源受体，相关的上游激酶包括Janus激酶(JAKs)，受体和非受体酪氨酸激酶(RTKs，Src，ABL)被激活，然后磷酸化STAT3蛋白TAD的Tyr705或Ser727。其中Src是对STAT3的组成性激活最关键的致癌蛋白之一，作为Src下游效应因子的Ras是活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的信号通路的中心调控因子。Ras-EKR信号通路中，Raf1和MKK1/2能发生连续的蛋白磷酸化，然后MKK1/2则能够磷酸化并激活ERK1/2。

对于其他分支，Ras/Rac1介导的p38和JNK活化，促进STAT3信号的激活。JNK通常受到MKK4/MKK7的活化，而MKK3/6则优先激活p38。Tyr705或Ser727的磷酸化可诱导STAT3二聚化、核转位、DNA结合以及靶基因活化。其下游基因参与多种生理过程，包括增殖(c-Myc、CDC2、周期蛋白D1)、存活(Bcl-2、Bcl-xL、存活素)、分化(GM-CSF)、转移(MMP-2/9)、血管生成(VEGF、HIF-1α、MMP-9)、免疫应答(COX-2、iNOS、PD-L1、CXCR4)。

图：STAT3信号通路

虽然多数情况下Tyr705或Ser727的磷酸化对于STAT3二聚化和核转位是必需的，但一些研究表明，在非经典的STAT3信号通路中，Lys685乙酰化也能稳定STAT3二聚体，进而启动靶基因的反式激活，STAT3乙酰化进一步增加某些肿瘤抑制因子基因的CpG岛甲基化。除了同源二聚化，STAT3也能与STAT1形成异源二聚体，然后转位到细胞核，结合靶基因的启动子原件以调控基因转录。除了作为直接的转录因子调控基因表达，STAT3似乎也能参与DNA甲基化和染色质修饰等表观遗传过程的调节。此外，STAT3也能在线粒体内被检测到，这有助于生物过程多样性，包括调节线粒体电子传递链(ETC)、细胞转化、心脏活动以及神经活动。

总之，在细胞中，STAT3信号通路能被多种信号激活并发挥多种生理/病理功能。同时、包含磷酸酶-1的Src同源区2结构域(SHP-1)和SHP-2、细胞因子信号的抑制因子(SOCS)、谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)，蛋白质酪氨酸磷酸酶受体T(PTPRT)、去乙酰化酶Sirtuin1(SIRT1)等负调控因子在STAT3信号传导中起负调控作用以维持生理条件下的瞬时激活状态。

正常生理条件下，STAT3信号受到严格的调控以维持瞬时活化状态。而在大约70%的人类实体瘤和血液瘤中发现持续性的STAT3活化，包括结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤和白血病等。此外，组成性STAT3活化与癌症不良预后关系密切。理论上，过度活化的STAT3可通过生成和维持肿瘤干细胞(CSC)或上调Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-1等抗凋亡相关蛋白而驱动失控的细胞增殖、存活并促进癌细胞对细胞毒和靶向药物的产生化学耐药。

此外，异常活化的STAT3也能通过诱导基质金属蛋白酶(MMPs,尤其是MMP-1、MMP-2、MMP-9)和其他STAT3靶基因的表达而促进肿瘤侵袭和转移。组成性活化的STAT3也能通过下调促炎细胞因子/趋化因子(对于抗肿瘤免疫应答必须的)和上调肿瘤/免疫抑制因子(VEGF、IL-10、PD1/PD-L1、COX2能够抑制免疫反应)，进而促进肿瘤免疫逃逸。因此，靶向STAT3蛋白是有潜力的肿瘤治疗治疗策略。

鉴于抑制STAT3信号在肿瘤治疗中的有益作用，科学家提出了多种方法，包括RNA干扰、小分子抑制剂调控上游调节因子(如JAK和Src)、激活/诱导负调节因子的表达以及直接靶向STAT3蛋白。RNA干扰在临床上未得到广泛应用，上游调节剂可能无法完全阻断由许多信号通路交联导致的STAT3活化，且可能存在作用选择性差的问题。因此，直接靶向STAT3小分子抑制剂的开发可能是一种阻断STAT3功能的可行方法。本文总结了直接靶向STAT3小分子抑制剂近五年的研究进展。

最早的STAT3抑制剂是一种分子探针，包括肽、拟肽和寡核苷酸，虽然提出了阻断STAT3的可行策略，但仍存在稳定性差、亲和力低、细胞渗透性差、生物利用度低等多种局限，限制了进一步临床发展。肽和寡核苷酸容易引起宿主免疫反应；拟肽是第一类靶向STAT3的抑制剂，但是没有分子成功进入临床；非肽类小分子具有多种优点而使得科学家致力于STAT3小分子抑制剂的开发，已有许多小分子成功进入用于肿瘤治疗的临床试验。

1、基于BTP衍生的STAT3抑制剂

SH2结构域是许多非肽类STAT3抑制剂分子的结合位点，SH2结构域蛋白表面具有三个溶剂可接近的亚口袋：磷酸化Tyr705(p-Tyr705)结合口袋(pY口袋，残基591、609-620)、Leu706亚位点(pY+1口袋，残基626-639)、疏水侧口袋(pY-X口袋，残基592-605)。其中pY亚口袋较宽，由极性残基Lys591、Ser611、Glu612、Ser613、Arg609组成，在STAT3与其他STAT成员的同源或杂源二聚化过程中，能与p-Tyr705形成氢键和盐桥；pY+1和pY-X主要为非极性和疏水，由Thr620、Trp623、Lys626、Gln635、Val637、Ile659组成的pY+1口袋是动态的，且难以靶向；由Glu594、Arg595、Ile597、Ile634组成的pY-X口袋是STAT3独有的，有助于设计选择性STAT3抑制剂。大多数STAT3抑制剂通常不止占据一个亚口袋，但三个口袋对于亲和力并不等同，pY口袋亲和力最高，因此许多STAT3抑制剂目的在于设计靶向pY口袋。

图：STAT3-SH2结构域结合口袋

苯并[b]噻吩1,1-二氧化物(BTP)是STAT3抑制剂的重要药效团。带有BTP片段的抑制剂在肿瘤细胞中通常通过抑制STAT3的Tyr705磷酸化和促进活性氧(ROS)产生而有效地抗细胞增殖和诱导细胞凋亡，代表分子有Stattic(1)、HJC0123(2)、HJC0146(3)。Stattic能通过线粒体电子传递链刺激形成ROS，乙烯基砜基团可与STAT3产生共价不可逆相互作用，对STAT3抑制是必需的。对接研究表明，BTP的平面性骨架仅占据关键的p-Tyr705结合位点，并与Arg609、Ser611、Ser613形成3个氢键。

图：BTP衍生的STAT3抑制剂

为了提高结合亲和力，研究人员在BTP的C6或C7位通过二级胺连接取代芳环以结合邻近的疏水口袋，获得化合物4活性最好，能够抑制MDA-MB-231、A549、MCF-7、HCT-116四种细胞的增殖，IC50为0.33μμM，活性比Stattic提高了1.5-12倍。5μM浓度下，4明显抑制STAT3的过表达、IL-6诱导的磷酸化以及DNA结合活性，对STAT3上游的p-JAK2、p-Src、p-Erk1/2等激活因子没有影响。此外，4也能通过下调STAT3下游基因Bcl-2的表达和增加ROS水平诱导肿瘤凋亡。对接研究表明，4能够填进SH2结构域，将其7-取代苯胺埋进侧链结合口袋与Arg609、Lys591、Ser636形成四个氢键，与Lys591、Arg609形成两个阳离子-π相互作用。

鉴于姜黄素(Curcumin,5)在多种肿瘤中的生物活性，研究人员设计了姜黄素-BTP偶联物作为可诱导生成ROS的STAT3抑制剂。结构上，引入哌嗪环作为中心linker以改善代谢稳定定性，获得杂合分子6具有明显的抗肿瘤活性、对MCF-7细胞的选择性(IC50为0.52μM)以及腹腔注射10mg/kg剂量能抑制MDA-MB-231移植瘤的生长，且没有明显毒性。6能够有效下调IL-6诱导的STAT3磷酸化和STAT3特异性的致癌基因表达，同时阻断STAT3介导的DNA结合活性，诱导的胞内ROS升高促进了癌细胞凋亡和周期阻滞。此外，6能通过下调P-糖蛋白(P-gp)表达而有效抑制耐药的MCF-7/DOX细胞生长，IC50为0.4μM。对接研究表明，6可紧密结合到SH2结构域上与Arg609、Lys626、Gln635形成三个氢键相互作用，其中哌嗪环linker提供了适合Leu706和pY705两个结合口袋相互作用的长度和角度。4-溴取代衍生物7具有强烈的抑制乳腺癌细胞增殖活性，在体内外均能阻断STAT3的活化。

图：BTP衍生的STAT3抑制剂

香豆素也是一种重要的STAT3抑制剂药效团。利用同样的策略，研究人员将香豆素和BTP组合获得化合物8，能够优先抑制STAT3的Tyr705和Ser727磷酸化，不影响STAT1/JAK2、Src以及Erk1/2的磷酸化水平，能下调STAT3靶基因Bcl-2和周期蛋白D1的表达，增加ROS生成，明显减少线粒体膜电位以触发线粒体凋亡途径。对接研究表明8能够结合到SH2结合域，占据pTyr705口袋和侧口袋，与Arg609、Lys591、Arg595形成四个氢键相互作用。

2、磺胺衍生物作为STAT3抑制剂

SH2结构域具有三个关键口袋，而多数已报道的STAT3抑制剂仅仅结合两个口袋，为了提高亲和力，开发了同时结合三个口袋的抑制剂是重要的方向。五氟苯基磺酰胺衍生物BP-1-102(9)是可口服的STAT3-SH2结构域抑制剂，最有进入临床前景。BP-1-102对STAT3的具有很强的结合亲和力(Kd=504nM)，抑制STAT3的DNA结合活性(IC50=6.8μM)，能选择性抑制STAT3依赖性的肿瘤细胞生长、存活、迁移、侵袭，同时抑制MDA-MB-231和A549异种移植瘤生长。基于BP-1-102结构优化获得的异羟肟酸化合物SH5-07(10)和苯甲酸衍生物SH4-54(11)，相比于BP-1-102两者活性明显提高，电泳迁移率变化分析(EMSA)的IC50S分别为4.7μM和3.9μM。

图：基于BP-1-102的结构优化

针对BP-1-102的N-甲基甘氨酸酰胺linker的优化以提高活性和理化性质为目的，研究人员以甲基取代甘氨酸亚甲基获得具有手性中心的丙氨酸衍生物，发现R构型的化合物12对STAT3的DNA结合抑制活性具有中等提高(IC50=3.0μM，BP-1-102为6.8μM)，而S-构型活性稍微降低(IC50=5.0μM)。进一步优化获得3-氟取代化合物13，相比于12其STAT3的DNA结合抑制活性提高近两倍，IC50为1.8μM。鉴于丙氨酸衍生物易于发生N-脱甲基化代谢，设计脯氨酸linker化合物14，其STAT3的DNA结合抑制IC50为2.4μM，微粒体代谢稳定性明显提高。进一步设计R-氮杂环丁烷-2-甲酰胺衍生物15，可强烈抑制STAT3活性，IC50为0.52μM，其衍生物16和17明显抑制细胞生长，在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的EC50为0.9-1.9μM。

结合BP-1-102和磺酰胺骨架设计同时结合SH2结构域三个口袋的STAT3抑制剂以提高选择性和类药性。设计化合物18能够抑制HCT-116细胞增殖(IC50=6.66μM)，阻止细胞聚集并诱导凋亡，能够剂量依赖性地抑制STAT3磷酸化，对STAT1/5/Src基本没有影响。对接研究表明，苯磺酰胺片段结合pY口袋与Arg609形成氢键相互作用，非极性的全氟苄基和异丙基苄基部分则分别占据pY-X和pY+1口袋。

TTI-101(19)是一种可口服的STAT3抑制剂，目前处于临床I期。基于TTI-101的结构改造获得S-linker化合物20对STAT3的亲和力是TTI-101的6倍，IC50分别为0.7μM和4μM。此外，在HL-60、MOLM-13、Kasumi-1细胞中剂量依赖性的降低STAT3磷酸化，IC50为0.8-1.9μM。相比于TTI-101，含Rh的萘酚磺酰胺化合物21具有更好的STAT3结合、磷酸化抑制和凋亡诱导活性。TTI-101通常被认为选择性结合STAT3的SH2区域，进而阻止酪氨酸磷酸化和二聚化，而21可以结合不同于SH2结构域的位点，直接结合到STAT3的CCD结构域的Phe174附近，抑制STAT3与pY-肽之间的相互作用。

图：磺酰胺衍生的STAT3抑制剂

ABT-751(22)是一种抗微管蛋白药物，目前处于I期临床试验。基于22的修饰获得化合物23在AsPC-1、A549、Hep3B、PC-3细胞中具有强烈的抗细胞增殖作用，平均GI50为57.5nM。机制上，23不仅抑制微管蛋白的多聚化，也抑制STAT3的磷酸化(IC50=0.2Μm)。基于ABT-751的改造获得的N-芳基磺酰基取代的吲哚衍生物24具有抑制STAT3和微管蛋白的双重活性。

氯硝柳胺(Niclosamide,25)是FDA批准上市的驱虫药，也具有STAT3抑制活性。鉴于−SO2NH2是与STAT3相互作用的关键基团，可作为氢键供体或给体，研究人员将亲水性的−SO2NH2引入氯硝柳胺以改善其水溶性和生物利用度，以−SO2NH2取代Cl获得化合物NGT02(26)，具有较好的亲水性，但抗癌活性降低。进一步结构修饰获得27，在MDA-MB-231、HCT-116、SW480细胞中抑制STAT3过表达(IC50=0.61-1.11μM)，效果稍微高于25。

3、醌类化合物作为STAT3抑制剂

醌类衍生物是高活性的亲电试剂，具有吸引力的活性分子。1,4-苯醌是最简单的醌类类衍生物骨架，具有多种生物活性。

BPMP(28)是一个可逆的STAT3抑制剂，能够抑制STAT3依赖性的转录活性，IC50为3.57μM，3μM浓度时明显阻断含有组成型STAT3的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的增殖。机制研究表明28不同于结合SH2结构域或DNA结合域的STAT3抑制剂，它不仅影响Tyr705和Ser727磷酸化及核转位，也能通过Michael加成反应选择性烷基化LD结构域的Cys550，28是第一个报道的STAT3-LD抑制剂。

图：醌类STAT3抑制剂

阿托伐醌(atovaquone,29)是FDA批准上市的抗菌药，也是有效的STAT3抑制剂，能够通过阻断STAT3酪氨酸磷酸化和转录活性，明显下调存活和增殖相关的关键靶基因表达。29能抑制NA-6、U266、HEL等具有IL-6产生介导的STAT3活化或者JAK2-V617F突变的细胞增殖。

化合物30是可口服的、有效的、选择性的STAT3抑制剂，具有很好的成药性。30能直接靶向STAT3的SH2结构域(Ki为440nM)，对STAT1/5没有明显结合。选择性抑制MDA-MB-231细胞的增殖(IC50=0.7μM)，且安全系数好、水溶性好、生物利用度44.7%。化合物31是潜在的结直肠癌治疗的候选药物，通过直接选择性的结合STAT3并阻断信号传导过程，体内外具有良好的抗肿瘤效果，能够抑制DNA结合和STAT3的转录活性。

白花丹醌(Plumbagin,32)是一种天然萘醌，能够抑制STAT3磷酸化，具有潜在的抗肿瘤活性。32能够伸进pTyr705口袋与Ser611形成氢键，与Lys591形成阳离子-π相互作用，但并未与侧口袋相互作用。为增加32的STAT3结合亲和力，研究人员引入芳环以同时占据pTyr705和侧口袋，获得的化合物33在MDA-MB-231、HepG2、A549细胞中活性是32的两倍，也能抑制STAT3磷酸化和下游基因Survivin及Mcl-1的表达，不影响上游酪氨酸激酶Src、JAK2、p-STAT1的表达。对接研究表明，33能够比32更紧密结合SH2结构域。

图：基于Napabucasin的改造

Shikonin(SHK,34)也是天然的具有STAT3抑制活性的萘醌，构效关系研究发现SHK能够占据pY-X和pY口袋与Lys591、Glu594、Ile634形成氢键。基于34优化获得的化合物35选择性阻断MDA-MB-231细胞中组成性STAT3的激活、转录活性、核转位以及下游靶基因的表达，剂量依赖性诱导细胞凋亡。体内移植瘤模型中具有明显抗肿瘤效果且没有明显副作用。同样的优化获得36在MDA-MB-231细胞中也具有很高的抗增殖活性，IC50为1.98μM。

芳环融合萘醌类化合物是一类STAT3抑制剂，呋喃并萘醌化合物Napabucasin(37)是一种靶向STAT3的干扰剂，2016年被FDA批准为胃癌/胰腺癌治疗的孤儿药。37通过靶向STAT3的SH2结构域而发挥作用。为了改善理化性质，在呋喃2位进行修饰得到化合物38，水溶性和抗癌活性增加，与STAT3的结合Kd为110.2nM。38在U251、HepG2、HT29、CT26细胞的增殖活性是37的10倍，IC50分别为0.22、0.49、0.07、0.14μM。

图：基于Napabucasin的改造

用N原子取代37侧链羰基获得化合物39-41，明显抑制具有组成性激活STAT3的HepG2细胞的存活，IC50分别为1.9、3.5、2.9μM。将Napabucasin的苯环开环并引入多样性基团以占据pY-X位点以提高STAT3结合亲和力，化合物42在MDA-MB-231、MDA-MB-468、HepG2细胞中通过抑制STAT3和降低下游基因周期蛋白D1和c-Myc的表达发挥抗增殖活性，IC50为0.67、0.77、1.24μM。42能直接靶向SH2结构域，IC50为5.18μM。对接研究表明，对甲氧基苯基能够占据pY-X位点，与Arg595和Ile634形成两个氢键相互作用。

基于Napabucasin和β-拉帕醌(43)设计的化合物44对STAT3的磷酸化抑制活性是Napabucasin的两倍(EC50分别为0.87和2μM)，在MDA-MB-231细胞中的抗增殖活性IC50则分别为为0.74和2.1μM。

图：基于Napabucasin和β-拉帕醌的改造

天然产物隐丹参酮(45)具有中等的STAT3抑制活性和有限的选择性，基于结构设计获得的两个isonapabucasin衍生物46和47活性明显增加。46可直接结合STAT3蛋白，Kd为6.6μM，可抑制STAT3过表达的HCT-116和RKO细胞增殖，IC50约为4μM。机制研究表明，46能抑制STAT3的Tyr705的活化、抑制核转位、下调转录激活活性，且不影响上游激酶。

图：苯环或杂环融合醌类化合物作为STAT3抑制剂

苯环融合萘醌(蒽醌)化合物48是虚拟筛选发现的STAT3抑制剂，对STAT3的结合亲和力为4.59μM，明显抑制STAT3的磷酸化和转录激活活性，明显抑制含有STAT3活化的MDA-MB-468细胞增殖抑制。异噻唑喹啉醌49也具有STAT3抑制活性，在纳摩尔水平上抑制肿瘤细胞增殖，以剂量依赖性的方式诱导A549细胞凋亡，活性为napabucasin的2.5倍。色氨酸能够被IDO酶(含血红素的氧化还原酶)代谢为犬尿氨酸被认为是肿瘤逃逸免疫监控的最重要机制之一，然而选择性抑制IDO能够有效刺激抗肿瘤免疫。研究人员开发了萘醌衍生物作为吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)和STAT3双重抑制剂，利用萘醌的肟化策略设计的肟衍生物50能够很好地结合IDO1和STAT3，Kd分别为0.08μM和0.53μM，对HCT-116、SKOV3、A549、HepG2细胞具有明显的细胞毒性，明显抑制免疫活性小鼠和裸鼠的肿瘤生长。

4、类黄酮及其类似物作为STAT3抑制剂

类黄酮是一类具有治疗活性的酚类衍生物，包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮、查耳酮、异黄酮和黄烷醇，具有多种生物活性和低毒性。

水飞蓟素(silibinin,51)是一个直接STAT3抑制剂，能够结合SH2结构域和DNA结合域，阻断STAT3的活化、二聚化、核转位、DNA结合、转录活性。芹菜素(apigenin,52)能够剂量依赖性的抑制STAT3的Tyr705的磷酸化，同时抑制STAT3核转位和转录活性，对黑色素瘤细胞具有抗转移作用。桑根皮素(morusin,53)在胰腺癌细胞中能够特异性抑制STAT3在Tyr705和Ser727位点的组成性激活。2'-羟基黄烷酮(2HF,54)能够增强胰腺癌细胞的化学敏感性。大多数的天然类黄酮化合物并不是直接的STAT3抑制剂，而是通过阻断上游激酶(JAK-1/2,c-Src)激活或者恢复STAT3负调控介导因子SHP-1/2的表达而抑制STAT3活化。相反，黄酮化合物可作为STAT3抑制剂，特别是查尔酮衍生物。

图：类黄酮化合物作为STAT3抑制剂

基于色酮的酰腙化合物55是有效的STAT5抑制剂，在55的6-位引入叔丁基获得化合物56，其STAT3抑制活性增加8倍，对STAT5活性大幅度降低，对接研究表明，叔丁基能够占据Pro639、Glu612、Ser613形成的口袋，56能够通过抑制STAT3的Tyr705磷酸化同时提高亲代HCC-827细胞的凋亡率和抑制厄洛替尼耐药的HCC-827细胞增殖。

图：黄酮类化合物作为STAT3抑制剂

α,β-不饱和羰基片段是查尔酮的关键骨架，能够作为Michael受体与亲核试剂发生反应而具有广谱的生物活性。烯酮衍生物57能够通过抑制STAT3磷酸化选择性抑制MDA-MB-231细胞的存活，当改变α,β-不饱和羰基片段时，STAT3抑制活性完全丧失。基于57的改造获得化合物58，对MBA-MB-231细胞的增殖抑制活性是57的大约3倍。对接研究表明58作为Michael受体靠近在STAT3蛋白的CCD的Michael供体Cys259，具有共价结合STAT3的潜力。

基于DBD靶向的STAT3抑制剂inS3−54(59)和inS3−54A18(60)设计得到的以α,β-不饱和羰基片段作为linker的衍生物61是一个新型STAT3抑制剂。61能够抑制H1299细胞的存活，IC50为8.1μM，结合DNA结构域Ki为3.92μM。

图：黄酮类化合物作为STAT3抑制剂

姜黄素(5)能够共价结合STAT3的Cys259而抑制STAT3活性，但是生物利用度低，活性差，基于姜黄素的结构修饰获得具有二酮结构的化合物62和63。与姜黄素相比，两者STAT3抑制活性增加。基于生物电子等排体对63的进一步改造获得化合物64，能有效抑制MDA-MB-231、DU145、A549细胞的增殖，IC50低于2μM，活性是姜黄素的12倍。64对STAT3的结合Kd为7.93μM，4μM时完全抑制Tyr705的磷酸化。对接研究表明，64能够同时结合p-Tyr705位点、Leu706位点和SH2结构域的侧口袋。

5、萜类作为STAT3抑制剂

萜类也是一类重要的天然产物类先导化合物。茶碱(bruceantinol,65)是具有抗CRC细胞增殖活性的化合物。机制研究表明，茶碱介导的抗癌效应伴随着明显的STAT3-DNA结合活性抑制，IC50为2.4pM，体内HCT-116细胞移植瘤中肿瘤体积降低54%。CrispeneE(66)能够抑制STAT3二聚化，IC50为10.27μM，能够选择性的降低STAT3依赖性的MDA-MB231细胞存活，IC50为5.35μM。对接研究表明66结合SH2结构比结合DNA结合域更强。呋喃二萜crispeneF(67)和crispeneG(68)是另外两个STAT3抑制剂，但活性相对较低，IC50为42和17μM。

真菌代谢物半乳糖内脂(galiellalactone,69)也是有效特异性的STAT3抑制剂，能够共价结合STAT3的半胱氨酸残基，阻断STAT3结合DNA。构效关系研究表明，去掉环己烯得到的双环内脂化合物70和71比69具有更好的抗肿瘤活性。对MDA-MB-468、MDA-MB-231、BT-549的增殖抑制IC50为6.61-12.14μM，通过抑制STAT3的Tyr705的磷酸化发挥作用，不同于69不影响STAT3磷酸化但阻断DNA结合。异戊内酯(72)也是一种体内外具有选择性的抗肿瘤活性的萜类衍生物，机制与诱导内质网应激和STAT3抑制有关，10μM时能够明显抑制STAT3的Tyr705的磷酸化，但是否通过共价相互作用发挥作用并不清楚。

图：萜类化合物作为STAT3抑制剂

虽然galiellalactone具有好的溶解性、渗透性以及中等的血浆和肝稳定性，但口服血浆暴露量很低。基于此设计得到的N-乙酰半胱氨酸甲酯偶联物73，口服后在大鼠中的血浆暴露量提升20倍。融合了噻唑环的化合物74能够强烈抑制多种癌细胞的生长，直接共价结合STAT3-linker结构域的Cys542，同时变构性地阻断STAT3的SH2结构域功能。并不是所有的萜类的α,β-不饱和片段都是主要的STAT3抑制因素，地塞米松衍生物75和76通过结合DBD结构域强烈抑制STAT3:STAT3/DNA复合过程，有效的抑制胶质瘤患者组成性STAT3驱动的癌细胞增殖，但是并不能通过利用75和76的α,β-不饱和片段对STAT3的Michael加成反应实现STAT3很弱的烷基化解释这种效果。

6、其他杂环化合物作为STAT3抑制剂

芳香杂环化合物具有多种生物活性。嘧啶和类嘧啶衍生物是最熟知的激酶抑制剂，也能作为STAT3抑制剂。

2-硫代嘧啶/查耳酮杂合物77和78具有很好的STAT3抑制活性，IC50分别为160μM和113μM。此外78能够抑制STAT5a，IC50为50.75μM。两个化合物均能明显抑制K562细胞的增殖，IC50分别为0.77μM和1.05μM。喹唑啉化合物79和80能够通过直接结合STAT3蛋白，干扰STAT3磷酸化，Kd为45μM和15.5μM，此外还能稳定G-四链体(G4)DNA结构。

图：嘧啶衍生物作为STAT3抑制剂

嘌呤衍生物S3I-V4-01(81)对STAT3具有高的亲和力，Kd10μM，但对MDA-MB-231细胞的抗增殖活性较差，IC50为82.4μM。通过移除S3I-V4-01的N9-羧甲基以提供与STAT3的Glu594形成氢键，并用不同取代基取代吗啡啉环和环己烷环，得到化合物82，具有很好的抗肿瘤增殖活性，对HCT-116、SW480、MDAMB-231细胞的增殖抑制IC50为1.77μM、1.51μM、1.25μM，活性比81增加了大约20倍。

喹啉衍生物STX-0119(83)是虚拟筛选发现的STAT3二聚化抑制剂，在包括替莫唑胺耐药的胶质母细胞瘤细胞等多种恶性肿瘤中具有抗肿瘤活性。基于STX-0119优化得到的喹啉甲酰胺化合物YHO-1701活性更好，但结构没有公布。

图：喹啉衍生物作为STAT3抑制剂

基于STX-0119结构设计喹啉-1,2,4-三唑/肟杂化物，假设基于肟的NO供体能够通过NO释放产生的细胞毒性，增强STAT3抑制活性。得到的化合物84和85活性明显得到提升，IC50S为7.7μM和1.9μM，在A375细胞中，能够直接结合SH2结构域，IC50为0.32μM和0.25μM，并且在几个癌细胞中阻断了STAT3酪氨酸磷酸化。结构上，肟的-OH能够与Arg595形成氢键作用，2-苯环能伸进有Ile634、Val637、Pro639、Thr632形成的疏水沟槽。

恶二唑环是STX-0119中的发挥STAT3抑制的关键药效团，基于结构的筛选发现ODZ10117(86)可特异性的抑制STAT3活性，与已知的S3I-201、STA-21和硝呋齐特相比，ODZ10117具有更强的STAT3抑制活性，能够直接阻断SH2结构域，进而抑制STAT3的同源二聚化和转录活性，介导对乳腺癌细胞的多种抗癌效应。

1,3,4恶二唑衍生物87也是一种STAT3抑制剂，能够强烈抑制SH2结构域，具有明显的STAT3抑制活性。基于结构的虚拟筛选发现氨基四唑衍生物88也是有效的STAT3抑制剂，能够靶向STAT3单体进而抑制二聚化和转录活性，IC50为25.7μM。构效关系研究表明，平面性和亲水性氨基四唑对于调控STAT2和STAT3抑制活性具有关键作用。

图：芳杂环衍生物作为STAT3抑制剂

1,2,5-恶二唑铂(II)复合物89具有与DNA相互作用和阻断STAT3信号的双功能。具有强烈的STAT3抑制活性，IC50为1.4μM，89对于HCT-116细胞具有更强的细胞毒性，IC50为18.4μM。研究人员设计将金属复合物和苯并呋喃连接以获得在前列腺癌治疗中具有STAT3和NF-κB双重抑制活性的铱(III)复合物90，能够直接影响STAT3和NF-κB，影响他们下游蛋白。在ELISA分析中，能阻断STAT3的DNA结合活性，IC50为12.2μM。

使用骨架融合策略，基于91设计了一系列2-乙酰基-7-苯基氨基苯并呋喃类似物以占据pY705位点和侧口袋。其中化合物92在MDA-MB-468细胞中具有最好的抗增殖活性，IC50为0.16μM。天然二氢苯并呋喃衍生物93对HGC27、MGC803、BGC823、AGS细胞也具有细胞毒作用，可能通过抑制STAT3磷酸化发挥活性。基于对接的虚拟筛选和结构优化得到的苯并噻唑衍生物94也是有效的STAT3抑制剂，能够阻断IL-6/STAT3信号通路，IC50为0.067μM，对MDA-MB-468和JAK2突变的HEL细胞具有明显的抗增殖作用，IC50为0.25μM和1.11μM。

虽然没有直接靶向STAT3的抑制剂获得FDA批准上市，但一些抗癌药物实际上通过STAT3抑制发挥相关的活性。上市药物苯达莫司汀(95)是一种烷化剂，通过结合DNA和干扰复制抑制癌细胞增殖。机制研究表明，95能够紧密结合STAT3，进一步分析发现95能够选择性共价拮抗STAT3-SH2结构域，抑制SH2与磷酸化肽相互作用。乙胺嘧啶是FDA批准上市的抗菌药，被发现是一种STAT3抑制剂，可抑制转录功能。与STAT3磷酸化抑制剂和STAT3-SH2结构域抑制剂能够阻断STAT3磷酸化、核转位或者DNA结合不同，乙胺嘧啶通过靶向二氢叶酸还原酶发挥STAT3抑制活性，目前处于I/II期临床，作为单独治疗治疗复发性慢性淋巴细胞白血病和小淋巴细胞淋巴瘤药物(NCT01066663)。

PROTAC是一种具有前景的新技术，是一种能够解决疾病相关蛋白异常表达的疾病治疗问题新方法。经典的PROTAC是一种双功能分子，由三个组分组成：靶向目标蛋白(POI)的配体，结合并募集E3连接酶的配体、将两个配体连接的linker。在细胞中，PROTAC能够同时结合POI和E3连接酶，进而导致POI泛素化和降解。相比于小分子药物，具有独特的优点。

图：靶向STAT3的PROTAC

CJ-887(96)是一个STAT3-SH2抑制剂，但是细胞渗透性很差(Ki=47nM)，进一步优化得到SI-109(97)，是合适的STAT3的配体，Ki=14nM。SI-109和STAT3-SH2结构域的共晶结构分析发现，SI-109的八元环的氨基是溶剂暴露的，是合适的连接E3连接酶位点，来那度胺和泊马度胺是两个理化性质很好的cereblon(CRBN)E3连接酶配体，通过linker优化发现了化合物SD-36(98)能够减少总STAT3和p-STAT3Y705蛋白水平，DC50为0.06μM和0.028μM，在Molm-16和SU-DHL-1细胞中，其有效的STAT3降解活性与细胞增殖抑制具有很好的相关性，IC50为0.013和0.61μM。此外，SD-36在Molm-16移植瘤中活性很好，每周一次50mg/kg剂量给药(共3周)，具有明显的肿瘤抑制活性，每周100mg/kg剂量完全抑制肿瘤细胞生长。

虽然靶向STAT3的癌症疗法尚未获得批准，但是相关研究结果已经证明了靶向STAT3的临床重要性，下表是进入临床的STAT3小分子抑制剂，其中一些取得较好的结果。

研究表明，STAT3的组成性激活与多种癌症相关，阻断STAT3信号能够抑制肿瘤生长、诱导凋亡、逆转获得性耐药、刺激免疫应答，并且对正常细胞具有良好的耐受性。因此，开发靶向STAT3小分子抑制剂已经成为具有前景的癌症疗法，在过去20多年时间里，已经发现了大量能够直接抑制STAT3活性的化合物。

目前，大部分直接靶向STAT3的抑制剂是靶向SH2结构域的化合物，因为SH2结构域在STAT3活化中的发挥关键作用。鉴于STAT1在肿瘤细胞增殖抑制中具有一定重要性，因此STAT3抑制剂应该不会对与STAT1密切相关蛋白的活性产生影响，且STAT1和STAT3的SH2结构域具有很大的相似性。由于仅仅靶向SH2结构域并不能完全抑制STAT3活性，因此开发同时靶向STAT3的DBD、LD、CCD等结构域以克服靶向SH2结构域小分子的局限是重要的STAT3抑制剂开发方向。除了直接抑制STAT3活性，降解STAT3蛋白也是另一个有效的肿瘤治疗方案，然而，开发靶向STAT3的PROTACs相比于小分子抑制剂更具挑战性。

目前，虽然没有STAT3抑制剂获批上市，但一些分子已经成功进入临床试验阶段，促使更多科学家继续致力于探索更有效的STAT3抑制剂和降解剂，将会为STAT3驱动的癌症和其他疾病治疗提供更好的方案。

参考文献：

1.JinyunDong,Jiang-JiangQin,erTherapy:,64,8884-8915.

2.邹杨,刘振明等.STAT3抗肿瘤抑制剂的研究进展[J].药学学报,2018,53(10):1598-1608.